清华大学附属垂杨柳医院病理科

　　引言

　　免疫组化（IHC）是病理诊断和研究中不可或缺的技术，但在实际操作中常会遇到染色弱、背景深、假阳性等问题。本文汇总了6类常见问题，并提供针对性解决方案，帮助您优化染色结果！

　　一、无着色或染色弱

　　可能原因：

　　1. 抗原修复不充分（如修复液pH值错误、时间不足）。

　　2. 一抗浓度过低或孵育时间过短。

　　3. 组织固定过度（如甲醛固定时间＞48小时）。

　　解决方案：

　　①优化抗原修复：

　　- 使用pH 6.0柠檬酸盐缓冲液（适用于大多数抗体）。

　　- 高压修复（121℃, 2~3分钟）比微波修复更彻底。

　　②调整一抗：

　　- 参考抗体说明书，进行浓度梯度测试（如1:50~1:400）。

　　③控制固定时间：

　　- 推荐 10%中性缓冲福尔马林固定6~24小时。

　　二、非特异性背景染色

　　可能原因：

　　1. 内源性过氧化物酶/生物素未完全阻断。

　　2. 一抗非特异性结合（尤其多克隆抗体）。

　　3. 组织干燥或切片过厚。

　　解决方案：

　　① 充分阻断：

　　- 使用3% H₂O阻断内源性过氧化物酶（室温10分钟）。

　　- 加正常血清（与二抗同源）减少非特异性结合。

　　②优化抗体：

　　- 换用单克隆抗体或进行抗体吸附实验。

　　③ 操作规范：

　　- 保持切片湿润，避免干燥；切片厚度控制在3~4μm。

　　三、细胞核/浆染色错位

　　可能原因：

　　1. 抗原修复过度（如高压时间过长）。

　　2. 一抗穿透性差（如大分子抗体）。

　　解决方案：

　　① 缩短高压修复时间至1~2分钟。

　　② 对胞核抗原（如Ki-67），可尝试酶修复（蛋白酶K）。

　　四、边缘效应（边缘染色深）

　　可能原因：

　　1. 切片边缘试剂残留（如未充分冲洗）。

　　2. 孵育时切片未水平放置。

　　解决方案：

　　①每步冲洗后，用滤纸吸干边缘液体。

　　② 使用湿盒保持湿度，确保孵育环境均匀。

　　五、阳性对照正常，待检样本无着色

　　可能原因：

　　1. 待检组织抗原丢失（如固定不当或长期储存）。

　　2. 组织预处理差异（如骨组织需特殊脱钙）。

　　解决方案：

　　① 重新取样，确保新鲜组织及时固定。

　　②对脱钙组织，改用EDTA脱钙液（避免强酸破坏抗原）。

　　六、DAB显色异常（过深/弥散）

　　可能原因：

　　1. DAB显色时间过长或浓度过高。

　　2. 显色后未及时终止反应。

　　解决方案：

　　显色时间控制在 1~5分钟，显微镜下监控。

　　显色后立即流水冲洗，或使用终止液。

　　总结：免疫组化优化流程图

　　1. 确认组织固定合格 → 2. 优化抗原修复 → 3. 调整一抗浓度/时间 → 4. 严格阻断内源性干扰 → 5. 规范操作（防干燥/边缘效应） → 6. 显色监控

　　小技巧：遇到问题时，建议先检查阳性对照是否正常，再逐步排查实验步骤！

　　您在IHC中还遇到过哪些问题？欢迎留言，我们将邀请专家解答！

　　参考文献

　　[1]王伯沄，李玉松. 免疫组织化学技术指南[M]. 3版. 北京：人民卫生出版社，2020.

　　[2]SUVARNA K S, LAYTON C, BANCROFT J D. Bancroft's theory and practice of histological techniques[M]. 8th ed. London: Elsevier, 2018.

　　[3]李华，王静，张雪. 抗原修复技术对免疫组化结果的影响[J]. 中华病理学杂志，2018，47(5)：345-349. DOI：10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2018.05.003.

　　[4]LIN F, CHEN Z, LIU Y. Nonspecific staining in immunohistochemistry: Causes and solutions[J]. Diagnostic Pathology, 2020, 15(1): 12. DOI: 10.1186/s13000-020-00934-y.

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